制備動(dòng)物模型使用的小動(dòng)物照射設(shè)備自身帶有防護(hù)設(shè)施，使用安全。

1．小鼠右肺局部照射后不同時(shí)間小鼠皮毛損傷性改變

小鼠右側(cè)肺部受到17 Gy照射，表皮會(huì)受到不同程度的損傷，白化損傷區(qū)域和照射區(qū)域重合，表明照射定位準(zhǔn)確（圖1）。如果出現(xiàn)局部破損及炎癥時(shí)給予抗生素軟膏涂抹。

2. 小鼠右肺局部照射對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)的影響

小鼠受照側(cè)肺組織HE染色后進(jìn)行鏡下觀(guān)察。病理學(xué)鏡檢人員單盲對(duì)組織切片進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果顯示小鼠右肺受照后8周開(kāi)始病理評(píng)分增高，表明小鼠右肺局部照射發(fā)生明顯病變，并且呈進(jìn)行性加重(見(jiàn)圖2)。

圖2小鼠右肺局部照射對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)的影響。圖A為鏡檢HE染色，100倍；圖B為肺組織病理學(xué)評(píng)分。肺組織病理學(xué)評(píng)分用mean±SE表示，n=6，a：與Control組相比p<0.01。

3. 小鼠右肺局部照射對(duì)肺組織膠原生成的影響。

觀(guān)察小鼠右肺局部照射后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺組織膠原生成的影響，結(jié)果顯示Control組小鼠肺組織幾乎看不見(jiàn)陽(yáng)性著色。受照組小鼠肺組織膠原沉積陽(yáng)性著色面積比增高，纖維化程度增高。表明小鼠右肺局部照射后肺組織中膠原沉積面積增大，并且呈進(jìn)行性加重（圖3A、B）。肺組織羥脯氨酸測(cè)定呈現(xiàn)相同趨勢(shì)（圖3C）。肺組織纖維蛋白相關(guān)基因表達(dá)水平受照后逐漸升高（圖3D、E）。上述結(jié)果提示小鼠右肺局部照射導(dǎo)致肺纖維化的模型成立。

圖3 受照后肺組織增生性改變（A，B）受照肺組織Masson染色及評(píng)分； C 受照肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定；（D，E）肺組織細(xì)胞內(nèi)纖維沉積相關(guān)因子mRNA的表達(dá)水平。

a，與control (CTL)相比 P<0.05；b, 與受照后(IR)8周組相比 P<0.05; c, 與受照后16周相比P<0.05

模型成立的指標(biāo)包括：1）小鼠接受大劑量（17Gy）胸部局部照射；2）受照后16周后受照肺組織進(jìn)行鏡下病理觀(guān)察，HE染色呈現(xiàn)纖維增生狀態(tài)，病理評(píng)分明顯升高；Masson染色綠色膠原沉積增多；肺組織勻漿檢測(cè)羥脯氨酸含量升高。3）進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)也可以觀(guān)察受照后小鼠30周存活率（非特異性指標(biāo)）；4）有條件時(shí)可以進(jìn)行小鼠MicroCT胸部成像進(jìn)行近期和遠(yuǎn)期觀(guān)察。

1. 實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6雄性小鼠（SPF級(jí)）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)[SCXK(京)2015-0035]，體重20.0-22.0 g，周齡8-12。

2. 照射條件 X線(xiàn)生物輻照儀（RS2000，美國(guó)Rad Source Technologies）照射，照射劑量為17 Gy，劑量率為3.12 Gy/min。照射面積為1.5 cm2，源皮距為15 cm。

3. 組織處理、切片 C57小鼠肺組織取材固定于4% 的中性甲醛24 h，修塊至肺組織最大橫截面，脫水后制作石蠟塊。用石蠟組織切片機(jī)制作4 μm的切片，切片常規(guī)HE染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)，封片后用正置顯微鏡（BX51，Olympus，Japan）觀(guān)察。

4.HE染色 組織切片在病理平臺(tái)進(jìn)行蘇木素-伊紅常規(guī)染色。HE染色后進(jìn)行鏡下觀(guān)察。病理學(xué)鏡檢人員對(duì)小鼠受照側(cè)肺組織組織切片進(jìn)行單盲評(píng)分。來(lái)自于動(dòng)物的右肺的全部被檢玻片均隨機(jī)化檢測(cè)。這一評(píng)分系統(tǒng)由一個(gè)0~12分范圍的可數(shù)評(píng)分組成，每張切片，由肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)纖維化滲出的嚴(yán)重度、血管周?chē)准?xì)胞浸潤(rùn)的程度進(jìn)行分類(lèi)評(píng)分，每種分類(lèi)根據(jù)病變程度又分為：0分為正常；1分為輕度；2分中度；3分重度；4分極重度。合并后記分。

5.Masson染色 肺組織切片在病理平臺(tái)常規(guī)處理，進(jìn)行Masson復(fù)合液染色，結(jié)果細(xì)胞核染黑藍(lán)色，膠原纖維呈綠色，神經(jīng)膠質(zhì)纖維、肌纖維、紅細(xì)胞呈紅色。圖像用單反數(shù)碼相機(jī)（D90，Nikon，Japan）進(jìn)行采集，肺組織橫截面積用Image-Pro Plus5.1（IPP，Media Cybernetics，Inc. USA）軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果用膠原沉積面積占組織總面積的比值表示。

6.肺羥脯氨酸含量測(cè)定 冷凍肺組織制備勻漿。使用羥脯氨酸比色分析試劑盒（BioVision，Milpitas，CA）測(cè)量勻漿中的膠原蛋白含量。數(shù)據(jù)以每毫克肺勻漿蛋白質(zhì)的微克羥脯氨酸表示。

7.小鼠纖維化相關(guān)基因PCR檢測(cè) 于照射后8周、16周、23周取小鼠右肺中葉，每組3只，迅速保存于-80℃冰箱，樣本處理后按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定分析。

一、疾病概述

放射性肺損傷（Radiation-inducedPulmonaryInjury）又稱(chēng)放射性肺炎（radiation pneumonia），是由于對(duì)胸部的惡性腫瘤進(jìn)行放射治療引起的并發(fā)癥，最多見(jiàn)于對(duì)肺癌、乳腺癌，其次是對(duì)食管癌、縱隔惡性腫瘤的放療。放射治療后在放射野內(nèi)的正常肺組織受到損傷而引起的炎癥反應(yīng)。輕者無(wú)癥狀，炎癥可自行消散；重者肺臟發(fā)生廣泛纖維化，導(dǎo)致呼吸功能損害，甚至呼吸衰竭。

1 病因 肺經(jīng)照射后，電離輻射產(chǎn)生的自由基損傷肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞功能不良和死亡是照射后致肺組織損傷的直接原因；同時(shí)，照射引起照射野局部細(xì)胞因子含量增多，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和趨化因子共同作用于照射區(qū)，使肺組織產(chǎn)生損傷，最終導(dǎo)致肺纖維化和肺硬化。

2.病理改變 急性期的病理改變多發(fā)生于放射治療后1～2月，表現(xiàn)為肺血管，特別是毛細(xì)血管損傷產(chǎn)生充血、水腫和細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡Ⅱ型細(xì)胞再生低下，淋巴管擴(kuò)張和透明膜形成。急性變化有可能自行消散，但常引起肺結(jié)締組織增生，纖維化和玻璃樣變。慢性期往往發(fā)生于放射治療9個(gè)月以后，病理為廣泛肺泡纖維化，肺臟收縮，毛細(xì)血管內(nèi)膜增厚、硬化，管腔狹窄或阻塞而導(dǎo)致肺循環(huán)阻力增高和肺動(dòng)脈高壓。胸膜也可因炎變和纖維化而增厚。細(xì)支氣管粘膜上皮間變，肺繼發(fā)性感染，可促進(jìn)放射性纖維化。

3.臨床表現(xiàn) 輕者無(wú)癥狀，多于放射治療后2～3周出現(xiàn)癥狀，常有刺激性、干性咳嗽，伴氣急、心悸和胸痛，不發(fā)熱或低熱，偶有高熱。氣急隨肺纖維化加重呈進(jìn)行性加劇，容易產(chǎn)生呼吸道感染而加重呼吸道癥狀。并發(fā)放射性食管炎時(shí)出現(xiàn)吞咽困難。若放射損傷肋骨，產(chǎn)生肋骨骨折，局部有明顯壓痛。體檢見(jiàn)放射部位皮膚萎縮、變硬，肺部可聞及干、濕羅音和磨擦音。肺部廣泛、嚴(yán)重纖維化，最后導(dǎo)致肺功能高壓及肺源性心臟病，出現(xiàn)相應(yīng)征象。

4.檢查手段

1）X線(xiàn)胸片：急性放射性肺炎發(fā)生于放療近結(jié)束時(shí)至放療后2個(gè)月內(nèi)，肺放射野內(nèi)呈片狀均勻密度模糊影，多發(fā)邊界不清的小斑片狀陰影，病灶邊緣與放射野一致，與正常肺組織有明顯分界，此為本病特征表現(xiàn)。

2）肺功能改變：肺放射性肺炎和纖維化都引起限制性通氣功能障礙，肺順應(yīng)性減低，伴通氣/血流比例降低和彌散功能減低，導(dǎo)致缺氧。有時(shí)胸片尚未發(fā)現(xiàn)異常，而肺功能檢查已顯示變化。

5.診斷與鑒別診斷 根據(jù)放射治療史，干性嗆咳，進(jìn)行性氣急和胸部X線(xiàn)有炎癥或纖維化改變可作出診斷，但應(yīng)與肺部腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移性腫瘤相鑒別，支氣管粘膜上皮經(jīng)照射后常引起細(xì)胞間變，應(yīng)與癌腫細(xì)胞相區(qū)別。

6.治療原則 主要是對(duì)癥治療，對(duì)僅有影像學(xué)表現(xiàn)而無(wú)臨床癥狀者，不予特殊治療；若有咳嗽、咳痰，對(duì)癥治療；肺部繼發(fā)感染給予抗生素，早期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素有效，抗凝療法治療小血管栓塞無(wú)效，給予氧氣吸入能改善低氧血癥。有清熱解毒、養(yǎng)陰益氣和活血化瘀功效的中藥具有不同程度的預(yù)防和治療放射性肺炎的作用，與西藥合用，能明顯緩解癥狀，改善放療后肺纖維化的病理改變，加速肺功能的恢復(fù)。

7.預(yù)防 為預(yù)防放射性肺炎的發(fā)生，應(yīng)科學(xué)合理制定放療方案，盡可能縮小照射面積，減少對(duì)正常肺組織的照射劑量。在放射治療過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)密觀(guān)察患者有無(wú)呼吸道癥狀及體溫升高。X線(xiàn)檢查發(fā)現(xiàn)肺炎，應(yīng)立即停止放射治療。

參考文獻(xiàn)

1. 劉樹(shù)錚, 主編. 醫(yī)學(xué)放射生物學(xué). 第3版. 北京: 原子能出版社, 2006.

2. 殷蔚伯,主編.腫瘤放射治療學(xué).第4版.北京: 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2008.

二、模型背景

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6J小鼠。

2、研究背景

放射性肺損傷是胸部放射治療的重要限制因素。尤其是放射性肺纖維化可以導(dǎo)致患者呼吸困難甚至嚴(yán)重的呼吸功能不全，使放療患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。根據(jù)判斷終點(diǎn)及影響因素的不同，放射性肺纖維化發(fā)病率報(bào)道的波動(dòng)范圍很大，可以從1%至43%。目前放射性肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚未闡明，臨床上也缺乏明確的早期診斷和有效治療方法，發(fā)病患者預(yù)后很差，因此對(duì)放射性肺纖維化機(jī)制的研究及防治藥物的研發(fā)一直是臨床亟需解決的問(wèn)題，也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

建立放射性肺損傷動(dòng)物模型對(duì)于發(fā)病機(jī)制研究、研發(fā)適用于臨床的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和有效的治療藥物具有重要的意義。研究使用最多的是在嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，目前認(rèn)為C57BL/6小鼠對(duì)放射性肺纖維化比較敏感。由于輻照設(shè)備的改善，可以進(jìn)行小動(dòng)物雙肺或單肺的局部照射制備模型。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室條件及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用的照射劑量、放射性肺損傷出現(xiàn)的性質(zhì)及程度略有差異；模型評(píng)價(jià)指標(biāo)多以受照動(dòng)物生存期和肺部病理改變?yōu)橹鳌＿@與臨床上放射性肺炎及纖維化形成多伴有胸膜癥狀不一致；臨床檢測(cè)包括有胸部影像學(xué)檢查、肺功能檢查在小鼠模型上難以操作。這可能是影響防治措施研究的臨床轉(zhuǎn)化的原因之一。

參考文獻(xiàn)：

1.陳孟毅，孟愛(ài)民. 肺纖維化動(dòng)物模型及研究進(jìn)展. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2016, 26(6):88-93

2.MacVittie TJ, Farese AM, Parker GA, Bennett AW,Jackson WE 3rd. Acute Radiation-induced Lung Injury in the Non-human Primate: AReview and Comparison of Mortality and Co-morbidities Using Models ofPartial-body Irradiation with Marginal Bone Marrow Sparing and Whole ThoraxLung Irradiation. Health Phys. 2020 Nov;119(5):559-587. doi:10.1097/HP.0000000000001346. PMID: 33009295.

3.Ghita M, Dunne V, Hanna GG, Prise KM, WilliamsJP, Butterworth KT. Preclinical models of radiation-induced lung damage: challengesand opportunities for small animal radiotherapy. Br J Radiol. 2019Mar;92(1095):20180473. doi: 10.1259/bjr.20180473. Epub 2019 Feb 13. PMID:30653332; PMCID: PMC6541188.

4.Dabjan MB, Buck CM, Jackson IL, Vujaskovic Z,Marples B, Down JD. A survey of changing trends in modelling radiation lunginjury in mice: bringing out the good, the bad, and the uncertain. Lab Invest.2016 Sep;96(9):936-49. doi: 10.1038/labinvest.2016.76. Epub 2016 Aug 1. PMID:27479087.